文献情報
Yu Tanaka; Haruka Nagano; Mei Okano; Takuya Kishimoto; Ayaka Tatsukawa; Hirofumi Kunitake; Atsushi Fukumoto; Yojiro Anzai; Kenji Arakawa, J. Nat. Prod, 2023, 1-6. DOI: 10.1021/acs.jnatprod.3c00476
化合物情報
単離
KA57株の抽出液
生物活性
KA57A: ビオラセイン産生の阻害（IC50 = 0.75 mg/mL）
KA57D1, KA57D2: 40%のクオラムセンシング阻害（1 mg/mL）
構造決定
構造決定の詳細
構造的特徴
全文和訳
Abstract
Streptomyces rochei 7434AN4の三重変異株（KA57株）は、親株や他の一重および二重変異株では検出されなかったアゾキシ-アルケン化合物KA57Aを生産する。この菌株はさらにいくつかのマイナー成分を蓄積し、その構造が解明された。KA57株のHPLC分析から、マイナー成分として2つのUV活性成分（KA57D1とKA57D2）の存在が示された。KA57D1とKA57D2はKA57Aとは異なる発色団を持つことが示唆された。KA57D1の分子式はC12H22N2O2であり、NMR分析の結果、KA57D1は新規なヒドラジド-アルケン化合物、(Z)-N-アセチル-N’-(ヘキ-1-エン-1-イル)イソブチルヒドラジドであることが判明した。標識研究により、KA57D1の窒素Nβはl-グルタミン酸由来であり、イソブチルアミドユニット（C-1〜C-3、2-Me、Nα）はバリン由来であることが示された。KA57D2の分子式はC13H24N2O2であり、その構造は(Z)-N-アセチル-N’-(hex-1-エン-1-イル)-2-メチルブタンヒドラジドであると決定され、その中の2-メチルブタンアミドユニットはイソロイシンに由来することが示された。KA57Aではl-セリン、KA57D1ではl-バリン、KA57D2ではl-イソロイシンという異なるNα原子の生合成は、KA57A、KA57D1、KA57D2の生合成における窒素-窒素結合形成のための基質認識が緩やかであることを示している。
ストレプトマイセス（Streptomyces）属は土壌に生息する糸状菌で、製薬上および農業上重要な二次代謝産物を生産する特徴的な能力を持つ。一般に、ストレプトマイセスのゲノムには二次代謝産物のための30以上の生合成遺伝子クラスター（BGC）が存在するが、そのほとんど（約80-90％）は実験室での培養条件下では弱く、あるいは全く発現しない。沈黙の二次代謝産物BGCを活性化するために、転写抑制因子の不活性化、転写活性化因子の過剰発現、主要二次代謝産物BGCの遮断、リボソーム工学、マイコール酸産生菌との複合培養など、いくつかの戦略が確立されている。(1-5)
Streptomyces rochei 7434AN4は、ランカサイジンCとランカマイシンという2種類のポリケチド抗生物質を生産し（図S1）、pSLA2-L、pSLA2-M、pSLA2-Sという3種類の特徴的な直鎖プラスミドを保有している(6-9)。(6-9)我々のグループは、これらの生合成機構(10-14)とシグナル分子依存的制御機構に焦点を当てている(15-20)。(15-20)特に、シグナル分子依存性制御遺伝子と主要な生合成経路について、遺伝子操作によるゲノムマイニングアプローチを試みている。ランカサイジン生合成遺伝子lkcAを変異させると、ペンタマイシン、シトレオジオール、エピ-シトレオジオールという3種類のポリケチドが蓄積した(21)。(21) ストレプトマイセス抗生物質制御タンパク質（SARP）型活性化遺伝子SRO_3163の過剰発現は、新規エナミドの蓄積を引き起こした。(22) 制御遺伝子srrYとsrrCの多重変異は、3種の4-一置換ブチロラクトンの蓄積をもたらした。(23)特に、転写抑制因子srrBとランカサイジンとランカマイシンの2つの生合成遺伝子に3重の変異を持つKA57株は、アゾキシアルケン化合物KA57A(1)を生産した。(24) KA57Aはもともと好気性放線菌Actinomadura sp.A7から単離されたもので、弱い抗真菌活性を示す。(25) KA57Aは、天然物では比較的珍しい官能基である双極性アゾキシ（N┥ N+─O-）発色団を持つ(26,27)。(26,27) 代表的なアゾキシ化合物には、エライオマイシン、(28-32) LL-BH872α、(33-35) バラニマイシン、(36-41) ジエタシン、(42) アゾキシマイシン、(43,44) アゾジレシン、(45) マニワマイシン、(46-48) KA57A(24,49)などがある（これらの構造を図S2に示す）。同位体標識された前駆体を用いた実験から、KA57Aはヘキセン-1-イルアミンユニットと2-アミノ-ブタン-3,4-ジオールユニットからなり、前者は通常の脂肪酸生合成によって酢酸から生じることが示された。後者のユニットは、セリンと酢酸のC-2に由来する。KA57株の[1′,1′-2H2]1′,2′-ジヒドロ-KA57Aの[1,1-2H2]1-ヘキシルアミンとのインキュベーション後の検出から、C1′-C2′脱水素がKA57A生合成の最終段階として起こることが示された。(24)
我々は、KA57A株におけるアゾキシ-アルケンKA57Aのユニークな生合成機構を明らかにするために、KA57株のマイナー代謝物を調べた。KA57D1とKA57D2（図1）と名付けられた2つのUV活性化合物が検出され、その構造が解明された。両者とも新規ヒドラジドであり、その生合成起源を標識前駆体とのインキュベーションにより調べた。
Result and Discussion
KA57株の抽出液のHPLCクロマトグラム（図2およびS3）から、KA57株はKA57A（1）および追加の代謝物（2および3）を蓄積していることが示された。KA57D1およびKA57D2と呼ばれる2および3はともに12.6分および18.7分で溶出し、一方1は9.7分で溶出した（図2A）。これらの化学構造を解明するため、大規模発酵培養からの抽出物をSephadex LH20とシリカゲルクロマトグラフィーで分画し、部分精製した2および3を得た。この混合物をさらに分取HPLCで分離し、2と3を得た（平均分離収率はそれぞれ0.80と0.16 mg/L）。2および3の分子式は、それぞれC12H22N2O2およびC13H24N2O2であることが確定された。
2のNMRスペクトルを測定し、1のスペクトルと比較した（表1および図S4-S8）。C1′-C6′における1Hおよび13Cシグナルの連結性は、2におけるシス-ヘキセン-1-イルアミンユニットの存在を示した（図2C-I）。2の13C NMRでは、11のシグナルが検出され、3つのメチル、3つのメチレン、3つのメチン、および2つの非プロトン化炭素に分類された。分子式と合わせて考えると、少なくとも1つのシグナルが重なっていた。メチル炭素シグナル(δC = 18.9)は、他よりも大きなピーク強度を示し、ダブレットプロトンシグナル(δH = 1.14)は、オレフィン性プロトンH-1′(δH = 6.35)で規格化すると6個のプロトンを持ち、イソプロピル部分の存在を示す。メチンプロトン、H-2（δH = 2.83）は、2つのメチル炭素、C-3とC2-Me（両方ともδC = 18.9）、およびカルボニル炭素、C-1（δC = 176.6）と3つの異核多重結合相関（HMBC）を有していた（図2C、パネルI）。二重項メチルプロトン（C-3とC2-Me）は、C-1とHMBCを示し、H-2とH-H COSYを示すことから、イソブチルアミドユニットの存在が示唆される。さらに、C-2″(δC = 20.8)の一重項メチル・プロトンH-2″(δH = 2.04)は、カルボニル炭素C-1″(δC = 169.0)とHMBCを示し、アセトアミド・ユニットの存在を示している。三重項メチルプロトンH-6′（δH＝0.90）から二重項オレフィン性プロトンH-1′（δH＝6.35、1JHH＝7. 6Hz）を介してH-6′（δH＝0.90）であることがH-H COSYにより確認され、HMBCシグナルがH1′-C3′，H3′-C1′，2′4′，5′，H5′-C4′，6′に検出された、 およびH6′-C4′にHMBCシグナルが検出され，KA57Aの場合(1)にすでに確認されている2のシス-ヘキセン-1-イルアミンユニットの存在を示した。(24) さらに、親イオン[C12H23N2O2]+のESI-CID-MS/MS分析(m/z 227 [M + H] +)により、2中のヘキセン-1-イルアミン、イソブチルアミド、アセトアミドの3つのユニットの連結性を確認した。図2Dに示すように、特徴的なフラグメントイオンである[C8H17N2O]+がm/z 157に観測され、これは2からイソブチルケトン部分（71amu）が消失したためである（図2D、パネルIの実線矢印）。また、m/z 98にイミニウムイオン[C6H12N]+が観測されたが、これはアセトアミドイオンの除去によるN-N結合の切断が原因と考えられる（図2D、パネルIの実線矢印）。このように、図1および2Dに示されるように、Nα原子はイソブチルケトンおよびアセチル部分と結合し、Nβ原子はシス-ヘキセン-1-イル部分と結合していた。
3の分子式（C13H24N2O2）と2の分子式（C12H22N2O2）を比較すると、3はさらにメチレン単位を持つことが示された。そのNMRスペクトル（図S9-S13）は、3が2と2つのユニット（シス-ヘキセン-1-イルアミンとアセトアミド）を共有していることを示している（表1）。メチンプロトン、H-2（δH = 2.66）は、メチレン炭素、C-3（δC = 26.9）、2つのメチル炭素、C-4とC2-Me（それぞれδC = 11.7と16.7）、およびカルボニル炭素、C-1（δC = 176.2）と4つのHMBCを持っていた（図2C、パネルII）。二重項メチル・プロトンC2-Me (δH = 1.12)はC-1とHMBCを形成し、三重項メチル・プロトンH-4 (δH = 0.91)はC-3とHMBCを形成する。メチレンプロトンであるH-3 (δH = 1.38)はC-1とHMBCを持つ。連続的なH-H COSY相関は、C2-MeからH-2、H-3、H-4を通して検出された。図1および2D、パネルIIに示すように、3のESI-CID-MS/MS分析により、3つのユニット、シス-ヘキセン-1-イルアミン、2-メチルブチルアミド、およびアセトアミドの連結性が確認された。
われわれのグループは、同位体標識した前駆体を用いて、KA57AとマニワマイシンGの2つのアゾキシアルケン化合物の生合成を以前に研究した(24,48)。(24,48)構造の類似性を考慮すると、2と3のC1′-C6′の炭素骨格は、1とマニワマイシンGで報告されたように、通常の脂肪酸生合成経路で組み立てられる可能性がある(24,48)。l-[15N]グルタミン酸を用いたインキュベーション実験から、1-3のβ位の窒素原子(Nβ)は、マニワマイシンGの生合成でも示されたように、l-グルタミン酸由来であることが明らかになった(48)。(48）2のNβ原子（δN＝134）は、1JNH＝90Hzの交換性プロトン（δH＝7.65）からの（1H-15N）HMQC（異核多重量子相関）を有し（図S14）、l-[15N]グルタミン酸の存在下で生成した2のH-2′からの（1H-15N）HMBCを有する（図S15）。従って、2のシス-ヘキセン-1-イルアミン単位は3つの酢酸単位とl-グルタミン酸に由来しなければならない。同様に、3のシス-ヘキセン-1-イルアミン単位も3つの酢酸単位とl-グルタミン酸に由来する（図S16とS17）。のl-[15N]グルタミン酸を用いたインキュベーション実験から、3のNβ原子（δN＝135）は、1JNH＝96Hzの交換性プロトン（δH＝7.53）から（1H-15N）HMQCを有し（図S16）、H-2′から（1H-15N）HMBCを有することが示された（図S17）。さらに、l-[15N]グルタミン酸を用いて、1のNβの供給源を確認した。図S18に示すように、H-2′/NβとH-1/Nαの間に2つの(1H-15N)HMBCが検出された；後者の相関は、マニワマイシンGの生合成で以前に報告されたように、セリンの生合成によって説明された（図S19とS20）。(48）全体として、1-3のシス-ヘキセン-1-イルアミン単位は、共通の前駆体である3つの酢酸単位とl-グルタミン酸に由来する（図3）。
2のイソブチルアミド単位（C-1〜C-3、C2-Me、Nα）の生合成起源は、その構造類似性からバリンであると予測され、l-[13C5,15N]バリンとl-[2H8]バリンを前駆体として用いてここで確認された。予想されたように、Nα原子は、H-1′、H-2′、およびH-2″と3つの長距離（1H-15N）HMBCを有する（図2C、パネルI、および図S21）。さらに、l-[13C5,15N]バリン(図4A,B)を前駆体として用いた場合、C-1/C-2間の52Hzのカップリングと、C-2/C-3とC-2/2-Me間の34Hzのカップリングで、13C標識のインタクトな取り込みが観察された。l-[2H8]バリンからの重水素標識は、2つのメチル基（C-3と2-Me）とC-2メチン基にも取り込まれた（図4C）。注目すべきことに、2つのメチル基とC-2メチン基の2H標識比は6:1ではなく、10:1以上であった（図4C）。これらのデータは、l-バリンが2のイソブチルアミドユニットの生合成前駆体であることを支持した。
同様に、3中の2-メチルブチルアミドユニットの生合成起源はイソロイシンであると予測され、l-[15N]イソロイシンを用いて支持されたが、この培養によって3は極めて低い収率で生産された。図2C、パネルIIおよび図S22に示すように、3のNα原子はH-1′と長距離（1H-15N）HMBCを有する。従って、3の2-メチルブチルアミド単位はl-イソロイシンに由来する。
KA57Aの類似体であるマニワマイシンC-G（図S2）は、クオラムセンシングの制御下で紫色の色素であるビオラセインを産生するC. violaceum CV026に対してかなりのクオラムセンシング阻害活性を有する(47,48)。(47,48)化合物1（アゾキシ-アルケン）は0.75 mg/mLのIC50値でビオラセイン産生を阻害したが、化合物2および3（ヒドラジド-アルケン）は1 mg/mLで40％のクオラムセンシング阻害しか示さなかった。マニワマイシンC-GのIC50値を考慮すると(47,48)、ビオラセイン産生を指標としたクオラムセンシング阻害活性にはアゾキシ発色団が重要である。
本研究では、2つの新規ヒドラジド-アルケンKA57D1とKA57D2を単離し、その化学構造と生合成起源を調べた。KA57D1、KA57D2およびアゾキシアルケンKA57Aは共通のシス-ヘキセン-1-イルアミン部分（C1′-C6′およびNβ）を有し、3つのアセテートとl-グルタミン酸に由来する。一方、それらのNα単位は異なるアミノ酸に由来する：KA57D1はl-バリン、KA57D2はl-イソロイシン、KA57Aはl-セリン。アゾキシ／ヒドラジド化合物の単一菌株での混合生産は、いくつかのストレプトマイセス株で報告されている。(49-52) Streptomyces sp. BK190は、アゾキシ-アルケンであるエライオマイシンと、2つのヒドラジド-アルケンであるエライオマイシンBおよびCを生産する（図S2）。(49,50）エライオマイシンはオクテン-1-イルアミンと3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-メトキシブタンユニットを持ち、エライオマイシンBとCは2つの共通ユニット（デシルアミドと2-メトキシアセトアミド）とC16-アルケニルアミンユニットを持つ。このように、様々なアゾキシ／ヒドラジド化合物の単離は、Streptomyces sp.BK190のエライオマイシン、Streptomyces sp.LMA-545のジェラシン、S. rochei 7434AN4のKA57A、KA57D1、KA57D2について、窒素-窒素結合形成の特異性が緩和であることを示している。図5はKA57A、KA57D1、KA57D2の初期段階の生合成を示す。ヘキシルアミンのN-酸化、セリルtRNAの合成、およびヘキシルヒドロキシルアミンとセリルtRNAの縮合のための3つの可能な酵素は、KA57A生合成遺伝子(azx)、マニワマイシン生合成遺伝子(mwm)、およびバラニマイシン生合成遺伝子(vlm)クラスターにコードされている。KA57D1とKA57D2の構築のために、活性化形態のl-バリンとl-イソロイシンをヘキシルヒドロキシルアミンと縮合して、O-（l-バリル）-ヘキシルヒドロキシルアミンとO-（l-イソロイシル）-ヘキシルヒドロキシルアミンを得、次に脱炭酸、C-1酸化、N-アセチル化、C-1′，2′-脱水素化などの反応を受け入れる（図5）。この段階では、アゾキシマイシンのazoC、(43,44)クレメオマイシンのcreDとcreE、(53)ヒドラジンs56-p1のspb38-40、(54)アクチノピリダジノン(55)のapy9を含む窒素-窒素結合形成の可能性のある遺伝子セットは、mwmとazxクラスターでは検出できなかった。
