クローン羊ドリー、DNA鑑定による冤罪の証明、新型コロナワクチンのmRNA技術——これらすべての土台にあるのが、たった4種類の塩基（A・T・G・C）の並びだけで生命の情報をコードする核酸（nucleic acid）の化学です。1953年にWatson・Crick・Franklin・Wilkinsが解明したDNAの二重らせん構造は、20世紀科学史上最大級の発見の一つであり、そこには有機化学の知識（水素結合・求核置換・ホスホエステル結合・SN1機構）がぎっしりと詰め込まれています。

第26章ではアミノ酸からタンパク質まで、第27章では脂質を学びました。本章はいよいよ生体分子4大グループの最後である核酸——DNAとRNA——を扱います。複製・転写・翻訳という「セントラルドグマ」の分子機構を有機化学の視点から理解し、さらにDNA配列決定（シーケンシング）・固相合成・PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）という、現代の分子生物学を支える実験技術の化学的な仕組みまで一気に学びましょう。

第28章のゴール
① ヌクレオシド・ヌクレオチドの構造（糖＋塩基＋リン酸）とホスホジエステル結合を描ける
② DNAとRNAの構造的な違い（糖の種類・塩基の種類・鎖の数）を説明できる
③ Watson-Crick型の相補的塩基対形成（A-T、G-C）と水素結合の様式を説明できる
④ DNAの半保存的複製のしくみと、リーディング鎖・ラギング鎖（岡崎フラグメント）の違いを説明できる
⑤ 転写によるmRNA合成のしくみと、センス鎖・アンチセンス鎖の関係を理解できる
⑥ コドン・アンチコドンの対応関係と、tRNAによる翻訳（タンパク質生合成）の流れを説明できる
⑦ Sangerジデオキシ法によるDNA配列決定の原理を説明できる
⑧ ホスホロアミダイト法によるDNA固相合成の5段階を再現できる
⑨ PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）の3段階（変性・アニーリング・伸長）とTaqポリメラーゼの役割を説明できる
Contents
  1. 28.1 ヌクレオチドと核酸
  2. 28.2 DNAにおける塩基対形成
  3. 28.3 DNAの複製
  4. 28.4 DNAの転写
  5. 28.5 RNAの翻訳：タンパク質生合成
  6. 28.6 DNAの配列決定
  7. 28.7 DNAの合成
  8. 28.8 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
  9. Chemistry Matters：DNAフィンガープリンティング
  10. まとめ：第28章 核酸

28.1 ヌクレオチドと核酸

タンパク質がアミノ酸からなる生体高分子であるのと同様に、核酸（nucleic acid）はヌクレオチド（nucleotide）が連結した生体高分子です。各ヌクレオチドはヌクレオシド（nucleoside）にリン酸基が結合した構造をしており、各ヌクレオシドはアルドペントース（5炭糖）が、そのアノマー炭素を通じて複素環性のプリンまたはピリミジン塩基の窒素原子に結合した構造をしています。

核酸 →[ヌクレアーゼによる加水分解] → ヌクレオチド（糖＋塩基＋リン酸）
ヌクレオチド →[ヌクレオチダーゼによる加水分解] → ヌクレオシド（糖＋塩基） + リン酸

RNAの糖成分はリボース、DNAの糖成分は2′-デオキシリボースです。ヌクレオチドの命名・番号付けでは、プライム（’）付きの番号は糖上の位置を、プライムなしの番号は複素環塩基上の位置を指します。したがって「2′-デオキシ」という接頭語は、リボースのC2’から酸素が欠落していることを意味します。

塩基 略号 分類 存在する核酸
アデニン A プリン DNA, RNA
グアニン G プリン DNA, RNA
シトシン C ピリミジン DNA, RNA
チミン T ピリミジン DNAのみ
ウラシル U ピリミジン RNAのみ

DNAには2種の置換プリン（A・G）と2種の置換ピリミジン（C・T）の合計4種類の塩基が含まれます。アデニン・グアニン・シトシンはRNAにも存在しますが、DNAのチミンの代わりにRNAでは近縁のピリミジン塩基であるウラシル（U）が使われます。

覚え方：DNAとRNAの2つの違い
①糖：DNAは2′-デオキシリボース（C2’に−OHなし）、RNAはリボース（C2’に−OHあり）。②塩基：DNAはチミン（5-メチルウラシル相当）、RNAはウラシル。この2点を押さえればDNA/RNAの構造比較問題のほとんどに対応できます。

ヌクレオチドはDNA・RNA中で、一方のヌクレオシドの5′-ヒドロキシ基と他方のヌクレオシドの3′-ヒドロキシ基がリン酸を介して連結するホスホジエステル結合［RO−(PO2−)−OR’］によって鎖状に連結されます。核酸ポリマーの一端はC3’に遊離のヒドロキシ基を持ち（3’末端）、もう一端はC5’にリン酸基を持ちます（5’末端）。鎖中のヌクレオチド配列は、5’末端から始めて塩基の出現順をG・C・A・T（RNAではU）の略号で表記します（例：TAGGCT）。

スケール感：DNAとRNAの大きさの違い
化学的には類似していますが、DNAとRNAは大きさが劇的に異なります。DNA分子は最大2億4500万個のヌクレオチドを含み分子量は最大750億にも達しますが、RNA分子はわずか21個のヌクレオチドしか含まないものもあり分子量は7000程度まで小さくなります。ATP・NAD+・FAD・コエンザイムA（第26章参照）といった核酸誘導体も、リン酸化剤・補酵素として多くの生化学経路に関与しています。

28.2 DNAにおける塩基対形成

同一種の異なる組織から単離したDNAは複素環塩基の比率が同じですが、異なる種のDNAでは塩基比率が大きく異なります。例えばヒトDNAはアデニンとチミンをそれぞれ約30%、グアニンとシトシンをそれぞれ約20%含みますが、細菌Clostridium perfringensではアデニンとチミンがそれぞれ約37%、グアニンとシトシンがそれぞれ13%しか含まれません。どちらの例でも塩基は対になって出現している点に注目してください——アデニンとチミンは常に等量、シトシンとグアニンも常に等量です。これはなぜでしょうか。

1953年、Rosalind Franklin・Maurice Wilkins・James Watson・Francis Crickは、DNAの二次構造を記述する科学論文を発表しました。彼らのモデルによれば、生理的条件下のDNAは2本のポリヌクレオチド鎖が逆方向に走りながら、らせん階段の手すりのように互いに巻き付いた二重らせん（double helix）を構成しています。2本の鎖は同一ではなく相補的であり、特定の塩基対（AとT、CとG）の間の水素結合によって結びつけられています。すなわち、一方の鎖にA塩基が現れるたびに、もう一方の鎖の対応する位置には必ずT塩基が現れ、一方にC塩基が現れればもう一方には必ずGが現れます。この相補的塩基対形成こそが、AとT、GとCが常に等量で見出される理由を説明しています。

塩基対 水素結合の数 分類の組み合わせ
A−T 2本 プリン−ピリミジン
G−C 3本 プリン−ピリミジン

静電ポテンシャル図で見ると、塩基の平面（面）は比較的電気的に中性ですが、エッジには正・負の領域が存在します。GとC、AとTを対にすることで、これらの逆電荷を持つ領域同士が向かい合う構造になります。

DNA二重らせんが1回転する様子を見ると、らせんの幅は20Å、1回転あたり塩基対は10対、1回転の長さは34Åです。2本の鎖が互いに巻き合う様式から、主溝（major groove、幅12Å）と副溝（minor groove、幅6Å）という2種類の「溝」が生じます。主溝の方がわずかに深く、両方の溝とも平面的な複素環塩基によって縁取られています。そのため、さまざまな多環芳香族分子が積み重なった塩基の間に横から滑り込む——インターカレーション（intercalation）——ことが可能で、多くの発がん性物質・抗がん剤がこの方式でDNAと相互作用します。

生物の遺伝情報は、DNA鎖中に連なったデオキシリボヌクレオチドの配列として保存されています。この情報を保存し将来の世代に伝えるには、DNAをコピーする機構が必要であり、情報を利用するにはDNAのメッセージを解読し指示を実行する機構が必要です。Crickが「分子遺伝学のセントラルドグマ」と呼んだものによれば、DNAの機能は情報を保存しRNAに伝達することであり、RNAの機能はDNAから受け取った情報を読み取り・解読し・タンパク質を作るために利用することです。この見方は大幅に単純化されていますが、出発点としては十分有効です。3つの基本的なプロセスが行われます。

  • 複製（replication）：情報を保存し子孫に伝えられるよう、DNAの同一コピーが作られる過程
  • 転写（transcription）：遺伝メッセージが読み取られ、タンパク質合成が行われるリボソームへ核外に運び出される過程
  • 翻訳（translation）：遺伝メッセージが解読され、タンパク質合成に利用される過程
DNA →[複製] → DNA
DNA →[転写] → RNA →[翻訳] → タンパク質
注意：相補的配列の決定は5’/3’方向に注意
相補鎖を決める際は、A↔T、G↔Cの置き換えだけでなく、必ず元の鎖の5’末端・3’末端の向きを確認すること。元の配列が（5’）TATGCAT（3’）であれば、相補鎖はそのまま置き換えると（3’）ATACGTA（5’）であり、5’→3’方向で書き直すと（5’）ATGCATA（3’）になります。向きを取り違えると配列が逆順になってしまうため、院試の頻出ミスポイントです。

28.3 DNAの複製

DNA複製は酵素触媒反応であり、ヘリカーゼと呼ばれる酵素によって鎖の各部位で二重らせんが部分的に巻き戻されることから始まります。水素結合が切断され、2本の鎖が分離して「バブル」を形成し、塩基がむき出しになります。続いて新しいヌクレオチドが各鎖に相補的な様式（AにはT、GにはC）で並び、バブルの末端——複製フォークと呼ばれる部位——から2本の新しい鎖が伸長を始めます。新しい鎖はそれぞれ元の鋳型鎖に相補的であるため、2つの同一なDNA二重らせんが生成します。新しいDNA分子はそれぞれ1本の古い鎖と1本の新しい鎖を含むため、このプロセスは半保存的複製（semiconservative replication）と呼ばれます。

ヌクレオチドの成長鎖への付加は5’→3’方向に進行し、DNAポリメラーゼ酵素によって触媒されます。重要な反応段階は、成長鎖の遊離3′-ヒドロキシ基へのヌクレオシド5′-三リン酸の付加であり、二リン酸が脱離基として失われます。

新しいDNA鎖はいずれも5’→3’方向で合成されるため、両者を同一の方式で合成することはできません。一方の新しい鎖は複製フォークの近くに3’末端を持ち、もう一方の新しい鎖は複製フォークの近くに5’末端を持つ、という違いが生じます。実際に起こることは、元の5’→3’鎖の相補鎖は連続的に1本のかたまりとして合成されリーディング鎖（leading strand）と呼ばれる一方、元の3’→5’鎖の相補鎖は不連続に小さな断片として合成されます。この断片は岡崎フラグメント（Okazaki fragment）（その発見者である岡崎恒子博士にちなんで命名）と呼ばれ、後にDNAリガーゼによって連結されラギング鎖（lagging strand）を形成します。

まとめ：リーディング鎖とラギング鎖の違い
DNAポリメラーゼは常に5’→3’方向にしか新生鎖を伸長できません。複製フォークが進む方向に対し鋳型鎖の向きが都合よく一致する側は連続的に合成され（リーディング鎖）、逆向きの鋳型鎖は複製フォークが進むたびに新たな起点から短く合成されては（岡崎フラグメント）DNAリガーゼでつなぎ合わされます（ラギング鎖）。

複製プロセスの規模は驚異的です。ヒトの各細胞の核には22対の常染色体に加えて2本の性染色体があり、合計46本の染色体が含まれます。各染色体は1つの非常に大きなDNA分子からなり、2セットの染色体に含まれるDNAの合計は約30億塩基対、すなわち60億ヌクレオチドと推定されています。これほど巨大な分子であっても、複製の際にはその塩基配列が忠実にコピーされます。コピー全体のプロセスはわずか数時間で完了し、校正・修復を経た後の誤りは100億〜1000億塩基につき約1回程度しか通過しません。実際、ヒトの一世代あたり親から子へ伝わるランダムな変異はわずか約60個程度です。

28.4 DNAの転写

前述のように、RNAはDNAと構造的に類似していますが、デオキシリボースの代わりにリボースを含み、チミンの代わりにウラシルを含みます。RNAには3つの主要なタイプがあり、それぞれ特定の役割を担います。さらに、細胞のさまざまな重要機能を制御すると見られる多数の小さなRNAも存在します。すべてのRNA分子はDNAよりはるかに小さく、二本鎖ではなく一本鎖のままです。

  • 伝令RNA（mRNA）：DNAからリボソーム（タンパク質合成が行われる細胞質中の小さな粒状粒子）へ遺伝メッセージを運ぶ
  • リボソームRNA（rRNA）：タンパク質と複合体を形成しリボソームの物理的な構造を提供する
  • 転移RNA（tRNA）：アミノ酸をリボソームへ運び、そこでアミノ酸同士が連結されタンパク質が作られる
  • 小さなRNA（機能性RNA）：転写のサイレンシングや他のRNA分子の化学修飾の触媒など、細胞内でさまざまな機能を持つ

DNA中の遺伝情報は遺伝子（gene）と呼ばれるセグメントに含まれ、各遺伝子は特定のタンパク質をコードする特定のヌクレオチド配列からなります。DNAからタンパク質への情報変換は、細胞核内でのDNAの転写によるmRNA合成から始まります。細菌では、このプロセスはRNAポリメラーゼがDNA上のプロモーター配列（典型的には転写開始部位の上流（5’側）に位置する約40塩基対からなる）を認識・結合することで始まります。プロモーター内には2つの六量体コンセンサス配列があり、1つは開始点の10塩基対上流、もう1つは35塩基対上流に位置します。

ポリメラーゼ-プロモーター複合体が形成された後、DNA二重らせんの数回転がほどけてバブルを形成し、両鎖の約14塩基対が露出します。適切なリボヌクレオチドがDNA上の相補的塩基と水素結合することで配列され、結合形成は5’→3’方向に進行し、RNAポリメラーゼがDNA鎖上を移動するとともに成長するRNA分子がDNAから巻き戻されていきます。常にどの時点でも、成長するRNAの約12塩基対がDNA鋳型と水素結合した状態を保っています。

DNA複製では両方の鎖がコピーされるのとは異なり、転写では2本のDNA鎖のうち一方のみがmRNAへ転写されます。遺伝子を含むDNA鎖はセンス鎖（コーディング鎖）と呼ばれ、転写されてRNAを生じるDNA鎖はアンチセンス鎖（非コーディング鎖）と呼ばれます。センス鎖とアンチセンス鎖が相補的であり、かつアンチセンス鎖と新生RNA鎖も相補的であるため、転写の際に生成するRNA分子はDNAセンス鎖のコピーになります（補集合の補集合は元に戻る、という関係）。唯一の違いは、DNAセンス鎖がTを持つ位置すべてに、RNA分子はUを持つという点です。

脊椎動物・被子植物におけるもう一つの重要な点は、遺伝子がDNA鎖上で連続したセグメントになっていないことが多いという点です。代わりに、遺伝子はまずDNAの一部であるエキソン（exon）から始まり、イントロン（intron）と呼ばれる非コード領域によって中断され、さらに下流の別のエキソンで再開します。最終的なmRNA分子は、転写されたmRNAから非コード部分が切り出され、残りの断片がスプライソソーム酵素によって連結された後に生成します。例えばトウモロコシのトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子は、DNA塩基対の約70%を占める8個の非コードイントロンと、残り30%を占める9個のコードエキソンを含みます。

注意：センス鎖とアンチセンス鎖の呼び方に混乱しないこと
「転写される鎖」＝アンチセンス鎖（鋳型鎖）、「遺伝子情報そのもの・mRNAと同じ配列を持つ鎖」＝センス鎖、という対応を取り違えやすいので注意してください。RNAポリメラーゼが直接読み取るのはアンチセンス鎖ですが、生成するmRNAの配列はセンス鎖のコピー（Tの代わりにUを持つ）になります。

28.5 RNAの翻訳：タンパク質生合成

mRNAの主要な細胞機能は、生物が必要とする数千種類の多様なペプチド・タンパク質（ヒトでは最大15万種ともいわれる）の生合成を指示することです。タンパク質生合成の実際の機構はリボソーム——細胞質中の小さな粒状粒子で、約60%のリボソームRNAと40%のタンパク質からなる——上で行われます。

mRNA中の特定のリボヌクレオチド配列は、アミノ酸残基が連結される順序を決定するメッセージを形成します。mRNA鎖上の各「単語」、すなわちコドン（codon）は、特定のアミノ酸に対応する3つのリボヌクレオチドの配列からなります。例えばmRNA上のUUCという配列は、成長するタンパク質へのフェニルアラニンの取り込みを指示するコドンです。RNA中の4種類の塩基が作る43＝64通りの可能な三連符のうち、61個が特定のアミノ酸をコードし、3個は鎖の終結をコードします。

分類 数 意味
アミノ酸指定コドン 61種 特定のアミノ酸の取り込みを指示
終止コドン 3種（UAA, UAG, UGA） 鎖の終結（タンパク質合成の停止）を指示

mRNAに埋め込まれたメッセージは、翻訳（translation）と呼ばれる過程で転移RNA（tRNA）によって読み取られます。アミノ酸を指定する61個のコドンそれぞれに対応する61種類の異なるtRNAが存在します。典型的なtRNAは一本鎖で、おおよそクローバーリーフ（四つ葉）型の形状をしています。約70〜100個のリボヌクレオチドからなり、tRNAの3’末端のリボースの3’ヒドロキシ基を通じたエステル結合で特定のアミノ酸に結合しています。各tRNAは中央の葉にアンチコドン（anticodon）と呼ばれるセグメントを持ち、これはコドン配列に相補的な3つのリボヌクレオチドの配列です。例えばmRNA上に存在するUUCというコドン配列は、相補的なアンチコドン配列GAAを持つフェニルアラニン結合tRNAによって読み取られます。

注意：アンチコドンを書くときは向きの反転を忘れない
ヌクレオチド配列は常に5’→3’方向で表記されるため、アンチコドンの配列は反転させる必要があります。すなわち（5’）-UUC-（3’）に相補的な配列は（3’）-AAG-（5’）であり、これを5’→3’方向で書き直すと（5’）-GAA-（3’）になります。単純にA↔T（またはU）、G↔Cで置き換えただけで終わらせず、必ず5’/3’の向きを反転させて書き直すことが必要です。

mRNA上の各コドンが順次読み取られるたびに、異なるtRNAが正しいアミノ酸を成長するペプチドへの酵素媒介転移のために正しい位置へ運びます。適切なタンパク質の合成が完了すると、「停止」コドンが終了を知らせ、タンパク質はリボソームから放出されます。

WORKED EXAMPLE：DNA配列から翻訳されるアミノ酸配列の予測

次のDNAコーディング鎖（センス鎖）の断片によってコードされるアミノ酸配列を求める例題です。

DNAセンス鎖：(5') CTA-ACT-AGC-GGG-TCG-CCG (3')
↓（転写：TをUに置き換える）
mRNA：(5') CUA-ACU-AGC-GGG-UCG-CCG (3')
↓（各コドンをアミノ酸に翻訳）
ペプチド：Leu-Thr-Ser-Gly-Ser-Pro

転写で生成するmRNAはDNAコーディング鎖のコピー（各TをUに置き換えたもの）になる、という28.4節の関係を使えば、コドン表を引くだけでアミノ酸配列を求めることができます。

28.6 DNAの配列決定

分子生物学では今まさに科学革命が進行中であり、科学者は生物の遺伝機構を操作・利用する方法を学び続けています。しかし、この数十年間の数々の特筆すべき進歩は、1977年に巨大なDNA鎖を配列決定する方法が発見されていなければ実現しなかったでしょう。

DNA配列決定の最初のステップは、巨大な鎖を既知の地点で切断し、より小さく扱いやすい断片を作ることです。これは制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）の利用によって達成されます。4000種類以上が知られ約600種類が市販されている各種の制限酵素は、それぞれ特定の塩基配列が出現する箇所でDNA分子を切断します。例えば制限酵素AluIは、4塩基配列AG-CTのGとCの間を切断します。この配列がパリンドローム（回文配列）であること——すなわち（5’）-AGCT-（3’）という配列は、両方を同じ5’→3’方向で読んだときその相補鎖（3’）-TCGA-（5’）と一致すること——に注目してください。他の制限エンドヌクレアーゼについても同様です。

元のDNA分子を切断特異性が異なる別の制限酵素で切断すると、最初の酵素で生成した断片と部分的に重複する配列を持つ別の断片群が生成します。すべての断片を配列決定し、重複領域を特定することで、DNA全体の配列を完全に決定できます。

DNA配列決定には現在十数種類の方法があり、さらに多くの方法が開発中です。Sangerジデオキシ法は最も頻繁に使われる方法の一つであり、ヒトゲノム全体（30億塩基対）を初めて配列決定する際に使われた方法です。市販の配列決定装置では、ジデオキシ法は以下の混合物から始まります。

  • 配列決定対象の制限断片
  • プライマーと呼ばれる短いDNA断片（制限断片の3’末端の配列に相補的）
  • 4種類の2′-デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）
  • 4種類の2′,3′-ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ddNTP）の少量（それぞれ異なる色の蛍光色素で標識。2′,3′-ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸とは、リボースの2’および3’位の−OH基がいずれも欠落したヌクレオシド三リン酸）

混合物にDNAポリメラーゼを加えると、プライマーの末端から制限断片に相補的なDNA鎖が伸長を始めます。大半の場合、混合物中の濃度がはるかに高い通常のデオキシリボヌクレオチドのみが成長鎖に取り込まれますが、時折ジデオキシリボヌクレオチドが取り込まれます。そうなると、鎖末端にさらにヌクレオチドを付加するための3′-ヒドロキシ基がなくなるため、DNA合成はそこで停止します。

反応が完了すると、生成物は可能なすべての長さのDNA断片の混合物となり、各断片は4種類の色素標識ジデオキシリボヌクレオチドのいずれかで終端しています。この生成物混合物はゲル電気泳動（第26.2節参照）により断片の大きさに応じて分離され、各断片中の末端ジデオキシリボヌクレオチドの種類——すなわち制限断片の配列——が色によって決定されます。

このオートメーション化されたジデオキシ法は非常に効率的で、長さ1100ヌクレオチドまでの配列を1時間あたり最大19,000塩基のスループットで、98%の精度で配列決定できます。10年間の研究と約5億ドルのコストを経て、ヒトゲノム全体（30億塩基対）の予備配列情報が2001年初頭に発表され、完全な情報は2003年に公開されました。それ以降、二重らせんの発見者の一人であるJames Watson自身を含む個人のゲノム配列決定も実現しています。1ゲノムあたりの配列決定価格は急速に低下しており現在では1,000ドル未満であり、個人の日常的なゲノム配列決定が実現可能な範囲に入っています。

注目すべきことに、ヒトゲノムにはわずか約21,000個の遺伝子しか含まれていないことが判明しています。これは以前予測されていた数の4分の1未満であり、一般的な線虫（roundworm）に見られる遺伝子数のわずか約2倍にすぎません。また、ヒトの遺伝子数（21,000）がタンパク質の種類数（おそらく50万種）よりはるかに少ないことも興味深い点です。この不一致は、ほとんどのタンパク質が翻訳後にさまざまな方式で修飾される（翻訳後修飾）ため、1つの遺伝子から最終的に多数の異なるタンパク質が生じることに起因します。

28.7 DNAの合成

分子生物学における進行中の革命は、オリゴヌクレオチド（オリゴ）と呼ばれる短いDNA断片の効率的な化学合成への需要の増大をもたらしました。DNA合成の課題はペプチド合成（第26.7節参照）と似ていますが、ヌクレオチド単量体の複雑さのためより困難です。各ヌクレオチドには複数の反応性部位があり、特定の時点で選択的に保護・脱保護する必要があり、さらに4種類のヌクレオチドのカップリングを正しい順序で行う必要があります。しかし現在では、最大200ヌクレオチド長のDNA断片を迅速かつ確実に合成できる自動DNA合成装置が利用可能です。

DNA合成装置は、Merrifield固相ペプチド合成装置（第26.8節参照）と類似の原理で動作します。要するに、保護されたヌクレオチドを固体支持体（シリカ）に共有結合させ、カップリング試薬を用いて一度に1つのヌクレオチドを成長鎖に付加していきます。最終のヌクレオチドが付加された後、すべての保護基が除去され、合成されたDNAが固体支持体から切り出されます。必要なステップは5段階です。

ステップ 反応 ポイント
1．固定 保護デオキシヌクレオシドをシリカ（SiO2）支持体に3′-OH側のエステル結合で固定 A・Cはベンゾイル基、Gはイソブチリル基で保護。Tは保護不要。5′-OHはDMT（p-ジメトキシトリチル）エーテルとして保護
2．脱保護 ジクロロ酢酸／CH2Cl2で5’位のDMT基を除去 SN1機構。第三級・ベンジル位のジメトキシトリチルカチオンが安定なため反応は速やかに進行
3．カップリング 固定化デオキシヌクレオシドと、3’位にホスホロアミダイト基［R2NP(OR)2］を持つ保護デオキシヌクレオシドを結合 溶媒はアセトニトリル（極性非プロトン性）。複素環アミンのテトラゾールが触媒。生成物はホスファイトP(OR)3。リン原子の酸素1つはβ-シアノエチル基で保護。収率99%超
4．酸化 2,6-ジメチルピリジン存在下、含水THF中のヨウ素でホスファイトをホスフェートへ酸化 「脱保護→カップリング→酸化」の3段階サイクルを目的の配列長まで繰り返す
5．最終脱保護・切断 含水アンモニアで全保護基を除去し、シリカとのエステル結合を同時に切断 電気泳動による精製で合成DNAを得る
まとめ：DNA固相合成とペプチド固相合成の対応関係
DNA合成装置の原理はMerrifield固相ペプチド合成法（第26章）と本質的に同じです。固体支持体への固定→脱保護→カップリング→（DNA合成では追加で酸化）の繰り返し→最終的な一括脱保護・切断、という流れが共通しています。違いは、ペプチドのアミド結合形成に対しDNAではホスホロアミダイト法によるリン酸エステル（ホスファイト→ホスフェート）形成を使う点です。

28.8 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）

犯罪現場などでは、直接得られるDNAの量がごくわずかであることがよくあり、配列決定や特性解析を行うためにより多くの量を得る方法が必要になる場合があります。1986年にKary Mullisが発明したポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、PCR）は、活字印刷機がグーテンベルクの発明として書物に対して果たした役割を、遺伝子に対して果たしたと評されています。活字印刷機が1冊の本の複数コピーを作るのと同じように、PCRは特定のDNA配列の複数コピーを作ります。鎖長10,000ヌクレオチドのDNAを1ピコグラム（pg）未満（1 pg = 10−12 g、約109分子）から出発して、PCRはわずか数時間で数マイクログラム（1 μg = 10−6 g、約1011分子）を得ることを可能にします。

ポリメラーゼ連鎖反応の鍵となるのはTaq DNAポリメラーゼという耐熱性酵素で、イエローストーン国立公園の温泉に生息する好熱性細菌Thermus aquaticusから単離されます。Taqポリメラーゼは、一端に短い相補鎖（プライマー）部分を持つDNA一本鎖を取り込み、相補鎖全体の構築を完了させることができます。全体の過程は3つのステップからなります。さらに近年では、海底の熱水噴出孔付近に生息する細菌から単離されたVentポリメラーゼ・Pfuポリメラーゼなど、より誤り率の低い耐熱性DNAポリメラーゼも利用可能になっています。

  1. ステップ1（変性、95°C）：増幅対象の二本鎖DNAを、Taqポリメラーゼ・Mg2+イオン・4種類のデオキシヌクレオチド三リン酸単量体（dNTP）、および目的DNA断片の両端の配列にそれぞれ相補的な約20塩基程度の短いオリゴヌクレオチドプライマー2種の大過剰の存在下で加熱する。95°Cで二本鎖DNAは変性し、自発的に2本の一本鎖へ分離する
  2. ステップ2（アニーリング、37〜50°C）：温度を37〜50°Cに下げ、相対的に高濃度のプライマーが各標的鎖の末端の相補配列に水素結合してアニーリングするのを促す
  3. ステップ3（伸長、72°C）：温度を72°Cまで上げ、Taqポリメラーゼが2本のプライマー結合DNA鎖へのさらなるヌクレオチドの付加を触媒する。各鎖の複製が完了すると、元のDNAの2コピーが存在することになる

変性・アニーリング・伸長のサイクルを2回目繰り返すと4コピー、3回目繰り返すと8コピーが得られ、これが指数的に続いていきます。

1サイクル目 → 2コピー
2サイクル目 → 4コピー
3サイクル目 → 8コピー
4サイクル目 → 16コピー
5サイクル目 → 32コピー ...（指数的に増加）

PCRは自動化されており、1時間あたり30回程度のサイクルを実行できるため、理論上の増幅倍率は230（約109）に達します。しかし実際には各サイクルの効率は100%未満であり、30サイクルで実験的には約106〜108倍程度の増幅が日常的に達成されています。

ポイント：PCRの3段階を温度で覚える
PCRは「95°C（変性・2本鎖を解離）→ 37〜50°C（アニーリング・プライマー結合）→ 72°C（伸長・Taqポリメラーゼによる鎖延長）」という温度サイクルの繰り返しです。この3温度とその役割（変性・アニーリング・伸長）の対応関係は院試で頻出のポイントです。

Chemistry Matters：DNAフィンガープリンティング

DNA配列決定法の発明は社会にさまざまな影響を与えましたが、その中でもとりわけ大きな影響を及ぼしたのがDNAフィンガープリンティングの発展です。DNAフィンガープリンティングは、1984年にヒトの遺伝子が短鎖タンデムリピート（STR）座位と呼ばれる、非コードDNAの短い繰り返し配列を含むことが発見されたことから生まれました。さらに、このSTR座位は一卵性双生児を除くすべての人で微妙に異なります。これらの座位を配列決定することで、各個人に固有のパターンを得ることができます。

DNAフィンガープリンティングの最も一般的かつ有名な用途の一つは、犯罪捜査研究所が血液・毛根・皮膚・精液など犯罪現場で見つかった生物学的証拠と被疑者を結びつけるために行うものです。これまでに数多くの裁判がDNA証拠に基づいて判決を下されています。

刑事事件での利用のために、米国の科学捜査研究所は個人識別に最も有効な13個の中核STR座位について合意しています。この13座位に基づき、Combined DNA Index System（CODIS）が確立され、有罪判決を受けた犯罪者の登録簿として機能しています。犯罪現場からDNA試料が得られると、その試料は制限エンドヌクレアーゼによる切断を受けてSTR座位を含む断片が切り出され、ポリメラーゼ連鎖反応によって断片が増幅され、断片の配列が決定されます。

既知の個人のDNA配列プロファイルと、犯罪現場で得られたDNAのプロファイルが一致する場合、そのDNAが同一人物由来である確率はおよそ820億分の1とされます。父子鑑定では、父親と子のDNAが完全に同一ではなく血縁関係にあるだけの場合でも、約10万分の1という確率で父親の身元を確定できます。さらに数世代を経ても、男系の直系子孫のY染色体のDNA解析から父系を推定することが可能です。

豆知識：DNAフィンガープリンティングの医療応用
DNAフィンガープリンティングの応用は犯罪捜査だけでなく、出生前診断・新生児診断を含む遺伝性疾患の診断にも広く使われています。囊性線維症・血友病・ハンチントン病・テイ-サックス病・鎌状赤血球貧血・サラセミアなど、多くの疾患が検出可能であり、罹患した子の早期治療を可能にします。さらに、特定の疾患の家族歴を持つ親族のDNAフィンガープリントを研究することで、疾患と関連するDNAパターンを特定し、将来的な治療法のヒントを得ることも可能になっています。

まとめ：第28章 核酸

第28章 概念整理
ヌクレオチドの構造：糖（DNAは2′-デオキシリボース、RNAはリボース）＋複素環塩基（プリンA・G、ピリミジンC・T/U）＋リン酸。ホスホジエステル結合で5’末端と3’末端を連結。
DNAの二重らせん：相補的塩基対形成（A-T：2本の水素結合、G-C：3本の水素結合）により2本の逆平行鎖が二重らせんを形成。主溝・副溝にインターカレーションが可能。
セントラルドグマ：複製（DNA→DNA、半保存的、リーディング鎖・ラギング鎖／岡崎フラグメント）、転写（DNA→mRNA、センス鎖のコピー＝Tの代わりにUを使用）、翻訳（mRNA→タンパク質、コドン・アンチコドン・tRNA）。
DNA配列決定：制限酵素による断片化＋Sangerジデオキシ法（ddNTPの取り込みで鎖伸長停止、蛍光色素で末端塩基を識別）。
DNA合成：ホスホロアミダイト法による固相合成。固定→脱保護（SN1）→カップリング（テトラゾール触媒）→酸化（ホスファイト→ホスフェート）の繰り返し→最終脱保護・切断。
PCR：Taq DNAポリメラーゼを用いた変性（95°C）→アニーリング（37〜50°C）→伸長（72°C）の温度サイクルにより、指数的にDNAを増幅。DNAフィンガープリンティング（STR座位・CODIS）に応用。

次章へのつながり

第28章では核酸（DNA・RNA）の構造から、複製・転写・翻訳というセントラルドグマの分子機構、そしてDNA配列決定・固相合成・PCRという実験技術の化学的基盤までを学びました。第25〜28章を通じて、糖質・アミノ酸・脂質・核酸という4大生体分子クラスをすべて概観し終えたことになります。これらの生体分子がどのように代謝され相互に変換されるか（クエン酸サイクルなどの代謝経路）は、これに続く章でさらに詳しく扱われます。

院試頻出ポイント：第28章
① ヌクレオシド・ヌクレオチドの構造とDNA/RNAの構造的差異（糖・塩基の違い）
② Watson-Crick型相補的塩基対形成（A-T、G-Cの水素結合数の違い）と二重らせんの構造（主溝・副溝）
③ 半保存的複製の機構、リーディング鎖・ラギング鎖（岡崎フラグメント）の違い
④ 転写におけるセンス鎖・アンチセンス鎖の関係とmRNA生成の仕組み
⑤ コドン表の読み方とアンチコドンの5’/3’方向の反転に関する計算
⑥ Sangerジデオキシ法の原理（ddNTP取り込みによる鎖伸長停止）
⑦ ホスホロアミダイト法によるDNA固相合成の5段階（特にSN1機構による脱保護）
⑧ PCRの3段階（変性・アニーリング・伸長）の温度条件とTaqポリメラーゼの役割